单细胞悬液制备技巧分享：做好这几点，细胞活率更稳定

　　做单细胞测序、流式细胞术或者细胞培养的都知道，真正决定实验质量的不是测序平台，也不是分析软件，而是前面的样品前处理制备。不少实验人员都有过类似经历：组织解离完成后，细胞数量不少，但活率偏低；或者细胞团块很多，过滤时堵筛网；再或者流式检测背景高、数据离散。很多时候，并不是后续实验出了问题，而是单细胞悬液制备阶段没有处理好。

　　单细胞悬液制备看起来只是把组织分散成单个细胞，实际上每一步都会影响到最终的实验结果。下面结合实验室的常见操作，总结几个容易忽略却非常关键的细节。

　　一、组织离体后尽快处理

　　组织样本离体以后，细胞活性会随着时间逐渐下降。尤其是肿瘤组织、脑组织、脾脏等活性较高的样品，如果长时间放置在室温环境中，很容易出现细胞凋亡增加、RNA降解等情况。

　　比较稳妥的方法，是样本取出后立即放入预冷保存液中，并尽快进入解离流程。如果需要运输，也建议全程低温保存，尽量缩短等待时间。

　　二、组织剪切大小要均匀

　　不少人认为有了单细胞悬液制备仪解离设备，就可以直接放整块组织进去。其实并不是这样。如果组织块太大，消化酶很难快速渗透到内部，容易出现外层已经解离，而中心仍然保持完整的情况。

　　一般建议将组织剪切成2～3毫米左右的小块，大小尽量保持一致，这样酶解效率更均匀，也能减少后续机械解离的压力。

　　三、不要一味延长酶解时间

　　很多实验失败后，第一反应就是是不是酶解时间太短？实际上，时间过长同样会影响实验。酶解不足，组织无法分散。酶解过度，则可能破坏细胞膜，降低细胞活率，甚至影响细胞表面抗原表达，对于后续流式检测尤其不利。

　　因此，不同组织应根据特点选择对应的酶种类、浓度和消化时间，不建议简单照搬其他实验方案。

　　四、机械吹打力度要适中

　　组织经过酶解后，很多人会反复用移液枪吹打，希望尽快得到更多单细胞。其实吹打次数越多，并不代表效果越好。力度过大容易造成细胞破裂，特别是免疫细胞、神经细胞等较脆弱的细胞，更容易受到机械损伤。

　　建议采用宽口枪头缓慢吹打，根据组织解离程度适当调整次数，不要为了追求数量而影响细胞质量。

　　五、过滤步骤不能省

　　解离结束后，一定要经过细胞滤网过滤。很多实验人员觉得样品已经比较均匀，就直接离心。实际上，没有解离好的组织碎块、纤维以及细胞团块都会影响后续实验。尤其是在流式细胞术或单细胞测序过程中，大颗粒组织容易堵塞仪器，也会增加双细胞比例。一般根据实验需求选择滤网，可以有效去除杂质，提高单细胞纯度。

　　六、离心参数不要盲目提高

　　有时候为了让细胞沉降更好，有人会提高离心速度。这种做法并不推荐。不同细胞对离心力的耐受程度不同，速度过高可能造成细胞损伤，尤其是一些原代细胞和免疫细胞。建议按照实验方案设置合适的离心速度和时间，既保证细胞回收率，又尽量减少机械损伤。

　　七、全程注意温度控制

　　很多组织样品对温度变化比较敏感。除酶解阶段需要恒温外，其余步骤通常建议保持低温操作。例如PBS、培养基提前预冷，离心结束后及时放回冰上，减少细胞代谢，提高活率。对于需要开展单细胞RNA测序的实验来说，这一点特别重要。

　　八、减少人为操作差异

　　实验室中，同一个样品由不同人员处理，得到的结果有时差异明显。原因就在于每个人剪切方式、吹打力度、混匀速度都不同。现在也有越来越多实验室开始使用单细胞悬液制备仪，就是希望将组织解离流程标准化。

　　单细胞悬液制备仪自动化解离设备能够按照设定程序完成恒温酶解、机械解离等步骤，减少人工操作带来的误差，对于批量样品处理和多中心实验尤为有帮助。

　　九、及时检测细胞活率

　　制备完成后，不建议直接进入下游实验。最好先进行细胞计数和活率检测。如果发现活率偏低、碎片较多或细胞团块明显，应先分析原因，再决定是否继续实验。这一小步虽然增加了一点时间，却能够避免后续测序、流式等实验失败带来的更大损失。

　　如何提高制备的单细胞悬液质量？

　　综合来看，高质量单细胞悬液通常具备几个特点：

　　1. 细胞分散均匀，没有明显团聚；

　　2. 活率较高，细胞膜完整；

　　3. 杂质和组织碎片较少；

　　4. 细胞浓度符合后续实验要求；

　　5. 重复实验结果稳定。

　　想达到这些目标，并不是依赖某一个步骤，而是整个前处理流程共同决定。从组织取材、低温保存、组织剪切，到酶解、机械解离、过滤、离心，每一步都需要规范操作。

　　很多人认为，单细胞实验真正难的是数据分析。实际上，前处理才是决定实验成败的重要环节。一份质量稳定的单细胞悬液，不仅能够提高细胞活率和回收率，也能为流式细胞分析、单细胞测序、细胞培养等实验提供可靠基础。

　　对于样本数量较多、实验重复性要求较高的科研团队来说，建立规范的单细胞悬液制备流程，并结合自动化单细胞悬液制备设备完成标准化操作，不仅能够减少人为误差，还能提升整体实验效率。